چکیده:
اهداف: امروزه یکی از مهمترین مشکلات در تشخیص پاتوژنهای انسانی، کمبود کنترل مثبت است. ایدۀ استفاده از حاملهای هیبریدی شامل ژنهای پاتوژنهای مختلف، میتواند به این محدودیتها غلبه کند. ما میتوانیم برای هر ناحیه پرایمرهای اختصاصی طراحی و از حاملهای هیبریدی به عنوان نمونۀ کنترل مثبت در واکنش زنجیرهای پلیمراز استفاده کنیم. در این پروژه، ما یک حامل هیبرید و پرایمرهای مربوطه را برای تشخیص فرانسیسلا، واریولا، بورخولدریا و یرسینیا بهصورت انفورماتیکی طراحی کردیم.
مواد و روشها: در این مطالعه ژنهای fopA، caf۱، ۱۶srRNA و HA به ترتیب به نمایندگی از فرانسیسلا، یرسینیا، بورخولدریا و واریولا برای قراردادن روی حامل انتخاب شدند. توالی این ژنها از پایگاه دادۀ NCBI به فرمت FASTA استخراج شد و برای یافتن ناحیۀ حفاظتشدۀ هر ژن، در نرمافزار BioEdit ۷. ۰. ۵. ۳ همردیفسازی شد. سپس تغییرات خاصی در هر منطقه ژنی اعمال گردید و توالیها در کنار یکدیگر قرار گرفتند و سازه مدنظر طراحی شد. پرایمرهای اختصاصی برای هر ناحیهی ژنی با استفاده از نرمافزارهای Oligo ۷، BioEdit و همچنین ابزار OligoAnalyzer و پایگاهدادۀ NCBI طراحی شد. در پایان در نرمافزار SnapGene ۳. ۲. ۰. ۱، سازه در حامل PUC۵۷ همسانهسازی شد و واکنش زنجیرهای پلیمراز روی حامل هیبریدی با استفاده از پرایمرهای طراحیشده، شبیهسازی گردید.
یافتهها: آنالیزها تایید کردند که نواحی حفاظتشده برای هر ژن روی حامل هیبریدی قرار گرفتند و شبیهسازی واکنش زنجیرهای پلیمراز، صحت پرایمرهای طراحیشده را تایید کرد.
نتیجهگیری: یک سازه هیبریدی شبیهساز ژنتیکی به همراه انواع پرایمرهای مورد نیاز برای شناسایی چهار عامل فرانسیسلا، واریولا، بورخولدریا و یرسینیا بهصورت بیوانفورماتیکی طراحی شده است تا بتوان با استفاده از آن به عنوان کنترل مثبت، در شرایط اضطراری بتوانیم اینگونه عوامل را شناسایی کنیم.
AIMS. Today, one of the most important problems in detection of human pathogens, is lack of positive control. The idea of using hybrid vectors, containing genes of different pathogens, can overcome this limitation. We can design specific primers for each region and use the hybrid vector as positive control sample in PCR. In this research we designed an in silico hybrid vector and relevant primers for detection of Francisella, Variola, Burkholderia and Yersinia.
MATERIALS & METHODS. In this study, fopA, caf1, 16srRNA and HA genes were chosen to be located on the vector, to respectively represent Francisella, Yersinia, Burkholderia and Variolla,. The sequence of these genes were obtained from NCBI in FASTA format and were aligned in BioEdit 7.0.5.3 software for finding conserve region of each gene, then some purposeful changes were applied in the sequence of each gene and the sequences were placed next to each other and the construct was designed. Specific primers were designed for each region using Oligo7, BioEdit, OligoAnalyzer tool as well as NCBI database. Finally, the construct was cloned in PUC57 in SnapGene 3.2.0.1 and PCR was simulated on hybrid vector using designed primers.
FINDINGS. Analysis confirmed that conserved regions for each gene were located on hybrid vector, and simulation of PCR proved the accuracy of designed primers.
CONCLUSION. A genetic simulator hybrid construct with the types of primers required to identify the four factors Francisla, Varivola, Borghuleria and Yersinia has been designed in silico so that such factors could be identified under positive control in emergencies.