چکیده:
سابقه و هدف: یکی از تکنیک های پایه ای مهم برای مطالعه یک پروتئین اختصاصی در بیولوژی مولکولی، کلون کردن و بیان آن در سلول می باشد. از جمله روشهای منتقل کردن ژن، روشهای غیر ویروسی است که کم هزینه تر، آسانتر و ایمنتر می باشند. یکی از ژن های مهم که کاربردهای بالینی فراوانی دارد ژن NT4 است. این ژن یکی از اعضای خانواده نوروتروفیک است و در سلول های گلیال سیستم اعصاب محیطی و مرکزی بیان می شود. این نوروتروفین در بیان ژنی، بقا و تمایز رده های مختلف نورونی شرکت دارد. هدف از انجام این پژوهش، ساب کلونینگ و ترانسفکت این ژن به منظور مطالعه و دسترسی بیشتر با توجه به نیاز به این فاکتور نوروتروفیک در فعالیتهای ژن درمانی است.
مواد و روشها: در این تحقیق، ژن NT4 با روش PCR در پلاسمید pCMV-SPORT6کلون گشته و پس از آن در باکتری اشرشیاکلی سوش DH5-α ترانسفورم شد. پلاسمید نوترکیب از باکتری میزبان استخراج و ژنNT4 با استفاده از آنزیم Not I ،Sal Iاز پلاسمید جدا گردید. در مرحله بعد پلاسمید برای پذیرش قطعه NT4 و انجام کلونینگ با آنزیم Hind III برش داده شد و ژن NT4 درون پلاسمید pEGFP-NI ساب کلون شد. محصول واکنش اتصال در باکتری فوق ترانسفورم و در محیط LB حاوی آمپی سیلین کشت داده شد. پلاسمیدهای نوترکیب با استفاده از کیت استخراج پلاسمید، از باکتری تخلیص و در مرحله بعد در سلول PC12 ترانسفکت گردید و در خاتمه بیان پلاسمید نوترکیبب با روشSDS PAGE ،western blotting مورد بررسی قرار گرفت.
یافته ها: آنالیز آنزیمی و تعیین توالی نشان داد پلاسمید ژن مورد نظر حاوی توالی صحیحی بوده و تطابق کامل با توالی ژن مورد نظر در بانک ژن دارد. در آنالیز پروتئین های جدا شده از سلول های ترانسفکت شده با روش SDS-PAGE، باندی حدود 45 کیلودالتون مشاهده شد که با آنتی بادی مونوکلونال در آنالیز وسترن بلات مورد تایید قرار گرفت.
نتیجه گیری: این پلاسمید به دلیل ساختار صحیح، جهت انتقال به سیستم یوکاریوتی و ارزیابی بیان مناسب می باشد.
Background and Aim: Cloning and expression in the cells is one of the most important basic techniques to study a specific protein in molecular biology. Among gene transfer methods، non-viral methods are less expensive، easier and safer to be implemented. NT4 is an important gene with miscellaneous clinical applications. This gene is a neurotrophic that induce survival، development and function of neurons as well as inducing differentiation of progenitor cells to form neurons. The aim of this study was to construct and transfect NT4 gene، in order to use it in research and gene therapy.
Materials and Methods: NT4 gene was subcloned in plasmid pcmvsport6، using PCR; then it was transformed in Escherichia coli bacteria strain DH5-alpha. The recombinant gene was extracted and restriction enzymes by NOTI، SAII. The fragment gene was legated into the PEGFP-N1 plasmid. Then by restriction enzymes HINDIII، the recombinant was detected through gel electrophosis. In order to ensure that recombinant gene is correct، it was sended for sequencing. Cell culture was prepared and the recombinant plasmid was transfected. SDS page and western blotting were used for detection of protein expression.
Results: Enzyme analysis showed that pcDNA had correct structure and sequencing، confirmed by 100% homology of the gene with reported alpha gene in Gene Bank. In the analysis of proteins isolated from transfected cells with SDS-PAGE، an approximately 45 kDa band was observed with monoclonal antibody which was confirmed by Western blot analysis.
Conclusion: This plasmid is able to transform to Eukaryotic system and is suitable for evaluation of translation due to its proper structure